01  การเพาะเลี้ยงเซลล์

การเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นขั้นตอนพื้นฐานที่สุดสำหรับการทดลองเกี่ยวกับเซลล์ โดยผ่านการเพาะเลี้ยงเซลล์ เราสามารถได้รับเซลล์จำนวนมาก ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับหน้าที่ของเซลล์และวิถีการส่งสัญญาณ ดังนั้นคุณภาพของการเพาะเลี้ยงเซลล์จึงส่งผลโดยตรงต่อการทดลองเซลล์ในลำดับต่อไปและความถูกต้องของผลลัพธ์

เซลล์มีความเปราะบางมากและจำเป็นต้องได้รับการดูแลเอาใจใส่อย่างดีเสมือนเด็กในระหว่างกระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ และจำเป็นต้องสังเกตสถานะของเซลล์ทุกวันเพื่อปรับระบบการเพาะเลี้ยงหรือดำเนินการตามความเหมาะสม เนื่องจากลักษณะการเจริญเติบโตของเซลล์แต่ละชนิดแตกต่างกัน จึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องไม่ดำเนินการอย่างเชิงกลไกและตายตัว

เนื่องจากสารอาหารในการเพาะเลี้ยงเซลล์ประกอบด้วยสารอาหารจำนวนมาก จุลินทรีย์ที่แพร่หลายอาจเพิ่มจำนวนได้ เมื่อใดก็ตามที่สารอาหารในการเพาะเลี้ยงเซลล์ปนเปื้อน จะแพร่กระจายอย่างรวดเร็ว ส่งผลต่อคุณภาพการเจริญเติบโตของเซลล์ ดังนั้นกระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ทั้งหมดควรปฏิบัติตามหลักการของการดำเนินการแบบปลอดเชื้อ

สารเคมีที่ใช้บ่อยและหน้าที่ของสารเคมี

▲สารอาหารพื้นฐาน (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

สารอาหารพื้นฐาน: ประกอบด้วยกรดอะมิโน วิตามิน คาร์โบไฮเดรต ไอออนอนินทรีย์ ฯลฯ เป็นหลัก ให้สารอาหารพื้นฐานและสภาพแวดล้อมการเพาะเลี้ยง (pH, ความเข้มข้นของ CO2) ที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ สารอาหารพื้นฐานที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ MEM, DMEM, RPMI-1640, F-12 ฯลฯ สารอาหารแต่ละชนิดเหมาะสำหรับเซลล์สายพันธุ์ต่างๆ

▲ซีรั่มจากลูกวัวที่ยังไม่เกิด (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ซีรั่มจากลูกวัวที่ยังไม่เกิด: เป็นสารเติมแต่งที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ซึ่งได้จากลูกวัวที่คลอดโดยการผ่าตัด และประกอบด้วยปัจจัยการเจริญเติบโต เปปไทด์ ฮอร์โมน โปรตีนจับ ฯลฯ ให้สารอาหารต่างๆ ที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ โดยทั่วไปจะใช้ความเข้มข้นของซีรั่มจากลูกวัวที่ยังไม่เกิด 10% ในสารอาหารในการเพาะเลี้ยงเซลล์ และความเข้มข้นที่เซลล์แต่ละชนิดต้องการนั้นแตกต่างกัน

▲ยาปฏิชีวนะสองชนิด (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ยาปฏิชีวนะสองชนิด: เป็นยาปฏิชีวนะที่ใช้กันทั่วไปที่สุดในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ส่วนประกอบคือเพนิซิลลินและสเตรปโตมัยซิน เพนิซิลลินมีผลในการฆ่าแบคทีเรียแกรมบวก สเตรปโตมัยซินส่วนใหญ่ทำงานร่วมกับแบคทีเรียแกรมลบ มักเติมลงในสารอาหารในการเพาะเลี้ยงเซลล์ในความเข้มข้น 1% เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของเซลล์ในระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์

▲สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS): คือสารละลายเกลือบัฟเฟอร์ที่ใช้กันทั่วไปที่สุดในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ประกอบด้วยไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟต โซเดียมคลอไรด์ โพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต หรือโพแทสเซียมคลอไรด์ ไอโซโทนิกกับเลือดมนุษย์ ใช้กันทั่วไปในการล้างเซลล์และการเตรียมสารเคมี

▲ทริปซิน (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ทริปซิน: โปรตีนที่หลั่งออกมาจากตับอ่อน ใช้กันทั่วไปในการย่อยเซลล์ที่ยึดเกาะและการกระจายเซลล์เนื้อเยื่อ มักจะเติม EDTA เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการย่อย ฤทธิ์การย่อยสามารถยับยั้งได้โดยซีรั่ม

เครื่องมือที่ใช้บ่อยและหน้าที่ของเครื่องมือ

▲ตู้อบเซลล์ (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ตู้อบเซลล์: เป็นอุปกรณ์ที่สำคัญที่สุดในกระบวนการเพาะเลี้ยงเซลล์ ให้สภาพแวดล้อมที่เหมาะสมสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงสำหรับเซลล์ส่วนใหญ่คือ 37℃, ความเข้มข้นของ CO2 5% และความชื้นที่เหมาะสม

▲ตู้ปลอดเชื้อ/ตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ตู้ปลอดเชื้อ/ตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ: เป็นอุปกรณ์หลักสำหรับการดำเนินการทดลองเซลล์ ซึ่งสามารถให้สภาพแวดล้อมในการดำเนินการที่ปราศจากฝุ่น ปลอดเชื้อ และมีความสะอาดสูง ตู้ปลอดเชื้อสามารถปกป้องตัวอย่างเซลล์ และตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพสามารถปกป้องทั้งตัวอย่างเซลล์และผู้ปฏิบัติงาน

▲กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้าน (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้าน: ใช้ในการสังเกตสภาพการเจริญเติบโตของเซลล์ในภาชนะเพาะเลี้ยง กล้องจุลทรรศน์ที่มีโมดูลเรืองแสงยังสามารถใช้สำหรับการสังเกตการเรืองแสงของเซลล์ในการทดลอง

▲เครื่องปั่นแยก (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

เครื่องปั่นแยก: ใช้ในการแยกเซลล์ออกจากของเหลว ตกตะกอนที่ด้านล่างของหลอดปั่นแยกและเก็บเซลล์สำหรับการเพาะเลี้ยงหรือการทดลองในลำดับต่อไป โดยทั่วไปจะใช้การปั่นแยกด้วยความเร็ว 100-200g เป็นเวลา 3-5 นาทีเพื่อแยกเซลล์

ภาชนะเพาะเลี้ยงที่ใช้บ่อย:

▲จานเพาะเลี้ยง (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

จานเพาะเลี้ยง: มีรูปทรงกลมแบน ทำจากพลาสติกและแก้ว เป็นภาชนะเพาะเลี้ยงเซลล์ทั่วไป ขนาดจะแตกต่างกันไปตามเส้นผ่านศูนย์กลางของจาน มีขนาด 35 มม., 60 มม., 100 มม., 150 มม. และขนาดอื่นๆ

▲จานเพาะเลี้ยง (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

ขวดเพาะเลี้ยง: รูปทรงขวด วัสดุโดยทั่วไปเป็นพลาสติก เป็นภาชนะเพาะเลี้ยงเซลล์ทั่วไป ขนาดจะแตกต่างกันไปตามพื้นที่ด้านล่าง (มม.²) มีขนาด T25, T75, T150, T175 และอื่นๆ

▲จานเพาะเลี้ยง (ภาพลิขสิทธิ์ ห้ามทำซ้ำโดยไม่ได้รับอนุญาต)

เพลทเพาะเลี้ยง: รูปทรงแผ่น มีหลุมเล็กๆ กระจายอยู่ทั่วไป โดยทั่วไปใช้สำหรับการทดลอง แบ่งตามจำนวนหลุม ได้แก่ เพลท 6 หลุม, เพลท 12 หลุม, เพลท 24 หลุม, เพลท 48 หลุม, เพลท 96 หลุม และอื่นๆ

02  การฟื้นฟูเซลล์

เซลล์จะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่ำมากเป็นเวลานาน โดยปกติจะอยู่ในตู้เย็นอุณหภูมิต่ำมากหรือกล่องไนโตรเจนเหลว เมื่อต้องการใช้เซลล์ในการทดลอง กระบวนการละลายเซลล์เรียกว่าการฟื้นฟูเซลล์

หลักการพื้นฐานของการฟื้นฟูเซลล์คือการละลายอย่างรวดเร็ว ซึ่งสามารถทำให้มั่นใจได้ว่าผลึกนอกเซลล์จะละลายในช่วงเวลาสั้นๆ หลีกเลี่ยงความเสียหายต่อเซลล์เนื่องจากการละลายอย่างช้าๆ ที่ทำให้เกิดน้ำซึมเข้าไปในเซลล์เพื่อสร้างการตกผลึกภายในเซลล์

วิธีการดำเนินการ:

①อุ่นเครื่องอาบน้ำให้ถึง 37℃

②นำหลอดแช่แข็งเซลล์ลงในเครื่องอาบน้ำและเขย่าอย่างแรงจนละลาย

③ถ่ายสารละลายเซลล์ลงในหลอดปั่นแยก เติมสารอาหารที่สมบูรณ์และปั่นแยก

③ถ่ายสารละลายเซลล์ลงในหลอดปั่นแยก เติมสารอาหารที่สมบูรณ์และปั่นแยก; ④ทิ้งสารเหนือชั้น ทำให้เซลล์กระจายตัวด้วยสารอาหารที่สมบูรณ์ใหม่และเพาะลงในภาชนะเพาะเลี้ยง

หมายเหตุ: เมื่อฟื้นฟูเซลล์ ควรทำอย่างรวดเร็วเพื่อลดการเกิดผลึกน้ำแข็ง เพื่อไม่ให้ลดความสามารถในการดำรงชีวิตของเซลล์หลังจากการฟื้นฟู หากจำเป็นต้องฟื้นฟูเซลล์จำนวนมากขึ้นในครั้งเดียว สามารถทำการละลายได้ทีละชุด และเวลาในการฟื้นฟูควรใช้เวลา 1 นาที สำหรับการละลายให้เสร็จสมบูรณ์ และไม่ควรเกิน 2 นาที

03  การย่อยและการถ่ายฝากยีนเซลล์

เมื่อเซลล์ที่ยึดเกาะเจริญเติบโตเต็มที่ในภาชนะเพาะเลี้ยงแล้ว เซลล์จะไม่สามารถเจริญเติบโตต่อไปได้และกิจกรรมของเซลล์จะถูกยับยั้ง ดังนั้นจึงจำเป็นต้องทำการย่อยและแยกส่วนก่อนที่เซลล์จะเจริญเติบโตเต็มที่ โดยปกติจะใช้การย่อยด้วยทริปซิน ทริปซินสามารถย่อยสลายและย่อยโปรตีนที่เชื่อมต่อเซลล์ที่ยึดเกาะได้ ทำให้เซลล์หลุดออกจากผนัง ส่วนเซลล์แขวนลอยเนื่องจากไม่ยึดเกาะกับผนัง จึงสามารถแบ่งใส่ขวดและแยกส่วนได้โดยตรง

วิธีการดำเนินการ:

ล้างเซลล์ 2 ครั้งโดยใช้ PBS

เติมทริปซินและบ่มที่ 37℃ เป็นเวลาหนึ่งช่วง

หลังจากเซลล์หดตัวเป็นรูปทรงกลมหรือหลุดออกเป็นชิ้นๆ ให้เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์เพื่อหยุดการย่อย เป่าเซลล์ลงและถ่ายไปยังหลอดทดลอง

หลังจากการปั่นแยก ให้ทิ้งสารละลายที่อยู่ด้านบน แขวนเซลล์ใหม่ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์ใหม่ และนำเซลล์ไปใส่ในภาชนะเพาะเลี้ยง

หมายเหตุ: เวลาในการย่อยเซลล์ควรปรับตามลักษณะของเซลล์ที่แตกต่างกัน เวลาในการย่อยไม่ควรนานเกินไป การย่อยนานเกินไปจะทำให้เซลล์เสียหายมากขึ้น ลดอัตราการรอดชีวิต ส่งผลต่อรูปร่างของเซลล์ และในขณะเดียวกันก็ไม่ควรอยู่ในกรณีที่การย่อยไม่เพียงพอที่จะบังคับให้เซลล์ถูกเป่าลง ซึ่งจะทำให้เซลล์เสียหายเช่นกัน

04  การแช่แข็งเซลล์

เมื่อไม่ใช้เซลล์ในช่วงเวลาสั้นๆ สามารถแช่แข็งเซลล์ที่อุณหภูมิต่ำ ซึ่งจะช่วยลดระดับการเผาผลาญของเซลล์ให้อยู่ในระดับต่ำมากโดยไม่จำเป็นต้องเติมสารอาหาร อย่างไรก็ตาม การแช่แข็งเซลล์ไม่ใช่การแช่แข็งเซลล์โดยตรง เนื่องจากน้ำภายในเซลล์จะเกิดเป็นผลึกที่เจาะเซลล์และทำให้เซลล์ตายได้ จึงจำเป็นต้องเติมสารป้องกัน DMSO เพื่อให้ระดับภายในเซลล์ซึมผ่านออกไปด้านนอกของเซลล์ได้ก่อน

วิธีการดำเนินการ:

เตรียมสารละลายแช่แข็งเซลล์ อัตราส่วนคือ อาหารเลี้ยงเซลล์:ซีรั่ม:DMSO=7:2:1 เซลล์ที่มีค่าสามารถเตรียมได้ตามอัตราส่วน ซีรั่ม:DMSO=9:1

เลือกเซลล์ในระยะล็อกการเจริญเติบโต ย่อยและปั่นแยก

ทิ้งสารละลายที่อยู่ด้านบน แขวนเซลล์ใหม่โดยใช้สารละลายแช่แข็งเซลล์ และแบ่งใส่หลอดแช่แข็งเซลล์ให้มีความหนาแน่นของเซลล์ 1×106 เซลล์/มล. ถึง 1×107 เซลล์/มล.

ใช้เครื่องมือควบคุมอุณหภูมิหรือกล่องควบคุมอุณหภูมิเพื่อลดอุณหภูมิของเซลล์ลงอย่างช้าๆ และเก็บไว้ในตู้เย็น -80℃ หรือกล่องไนโตรเจนเหลวเพื่อการเก็บรักษาในระยะยาว

05  การศึกษาเฉพาะกรณี

Huaren Medical ให้บริการเพาะเลี้ยงเซลล์อย่างมืออาชีพ ทีมวิจัยได้ทำการเพาะเลี้ยงเซลล์หลายสายพันธุ์และเซลล์หลักหลายร้อยสายพันธุ์ สามารถปรับเปลี่ยนได้ตามลักษณะของเซลล์เพื่อให้ได้วิธีการเพาะเลี้ยงที่ดีที่สุด ในขณะเดียวกันเรายังให้บริการที่กำหนดเองสำหรับเซลล์สายพันธุ์พิเศษ รวมถึงเซลล์สายพันธุ์ที่ถูกตัดต่อด้วย CRISPR เซลล์สายพันธุ์ที่ต้านยา เซลล์สายพันธุ์ที่แสดงออกมากเกินไปอย่างเสถียร และอื่นๆ

▲cytogram

· จบ ·